Está ubicado en la parte posterior izquierda del antiguo templo de la Virgen de Guadalupe. Tiene la misión de resguardar y exhibir las obras artísticas encargadas o adquiridas durante varios siglos por el clero. Fue inaugurado el 12 de octubre de 1941 por iniciativa de monseñor Feliciano Cortés y Mora y del Cabildo Guadalupano. Durante la gestión de monseñor Guillermo Schulenburg en 1976, año de inauguración de la nueva Basílica, se le asignaron nuevos espacios y se le dotó de un acceso directo desde el atrio. Reinagurado en julio de 1986, alberga la más importante colección de obras artísticas relacionadas con el culto guadalupano, así como con un valioso acervo de arte novohispano, europeo y asiático de los siglos XV al XX. Las piezas son exhibidas en el corredor de acceso, en el vestíbulo (antigua sacristía) y en las 12 salas que lo integran. Desde 1972 cuenta con su propio taller de conservación. En 2002, el edificio y parte de su acervo fueron restaurados por especialistas del Instituto Nacional de Bellas Artes.